LC-MS/MS法测定尼扎替丁原料药中的N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺

　　摘要：目的采用液质联用法测定尼扎替丁原料药中的N-亚硝基二甲胺(NDMA)和N-亚硝基二乙胺(NDEA)。方法样品用30%甲醇溶解，涡旋1 min后，经液相色谱分离，用质谱法确认化学成分，外标法计算含量。质谱采用大气压化学电离源，正离子模式，多反应监测，NDMA定量离子对为75.0/43.0，定性离子对为75.0/57.9,NDEA定量离子对为103.0/75.0，定性离子对为103.0/47.0。结果 NDMA和NDEA的线性范围分别为0.9514～23.7838 ng·m L-1(r=0.9997)、0.09934～7.4582 ng·m L-1(r=0.9999)，平均回收率分别为95.5%、97.3%(n=9)。6批原料药均未检出NDEA,NDMA的检出量远小于0.32μg·g-1的限度。结论所用方法可用于测定尼扎替丁原料药中的NDMA和NDEA。

　　关键词：尼扎替丁雷尼替丁 H2受体拮抗剂 N-亚硝基二甲胺 N-亚硝基二乙胺液质联用法致癌毒性三重四极杆质谱仪

　　Determination of N-nitrosodimethylamine and N-nitrosodiediamine in Nitzatidine by LC-MS/MS

　　FENG Yuwei YUAN Jun LIU Feng WANG Lu QIAN Guangsheng

　　West China College of Pharmacy,Sichuan University; Sichuan Food and Drug Inspection and Testing Institute;

　　Abstract：OBJECTIVE To determine N-nitrosodimethylamine( NDMA) and N-nitrosodiediamine( NDEA) in Nitzatidine by LC-MS/MS. METHODS The sample was dissolved in 30% methanol,mixed by vortex for 1 minute,separated by liquid chromatography,confirmed by mass spectrometry,and calculated by external standard method. The MS/adopted atmospheric pressure chemical ionization source,positive ion mode,multi reaction monitoring. The quantitative ion pair of NDMA was 75. 0/43. 0,the qualitative ion pair was 75. 0/57. 9,the quantitative ion pair of NDEA was 103. 0/75. 0,and the qualitative ion pair was103. 0/47. 0. RESULTS The linear ranges of NDMA and NDEA were 0. 9514-23. 7838 ng·m L-1( r = 0. 9997) and0. 09934-7. 4582 ng·m L-1( r = 0. 9999),respectively. The average recoveries were 95. 5% and 97. 3%,respectively( n = 9).No NDEA was detected in six batches of APIs,and the detection amount of NDMA was far less than the limit of 0. 32 ppm.CONCLUSION The established methods can be used for the determination of NDMA and NDEA in Nitzatidine.

　　Keyword：Nitzatidine; Ranitidine; H2 receptor antagonist; NDMA; NDEA; LC-MS; Carcinogenicity; Triple quadrupole mass spectrometer;

　　尼扎替丁是第三代H2受体拮抗剂，其结构中含有噻唑环、仲胺基和叔胺基的全人工合成药物，具有抑制胃酸分泌的作用[1-2]。N-亚硝胺是一类以亚硝基-NO的氮原子与氨基中的氮原子连接，并在氨基上发生取代而生成的一类化合物，其生成机制多样，包括仲胺类化合物与亚硝酸之间的相互作用、叔胺类化合物与一氯胺之间的亲核取代反应等[3]。N-亚硝基二甲胺(ND-MA)是一种工业和环境污染物，具有强烈的致癌毒性、致畸性和致突变性[4]。2019年9月13日，FDA提醒患者和医护人员在雷尼替丁中发现NDMA[5]。尼扎替丁与雷尼替丁结构类似，同属替丁类药物，都含有仲胺和叔胺基团，为严格把控药品质量安全，需全面评估尼扎替丁中的杂质NDMA的量，另需增加潜在杂质N-亚硝基二乙胺(NDEA)的测定。现采用LC-MS/MS法来检测尼扎替丁原料药中的NDMA和NDEA，并进行了方法学验证。

　　1 实验部分

　　1.1 仪器与试药

　　LC-30AD型高效液相色谱仪(日本岛津);5500三重四极杆质谱仪(美国AB-Sciex)。尼扎替丁样品(批号:171101、171102、191101、191102、191103、191104，四川摩尔生物制药有限公司);N-亚硝基二甲胺(TCI，含量>99.0%);N-亚硝基二乙胺(J&K，含量99%);水为超纯水;甲醇为色谱纯;其余试剂为分析纯。

　　1.2 方法与结果

　　1.2.1 LC-MS/MS条件

　　采用Agilent Poroshell120 EC-C18色谱柱(150 mm×4.6mm,2.7μm)，柱温45℃，流动相A为0.1%甲酸，流动相B为0.1%甲酸甲醇液，按表1中的程序进行梯度洗脱，流速1.0 m L·min-1，进样器温度10℃，进样量10μL;采用三重四级杆串联质谱检测器，APCI源，正离子模式，碰撞气(CAD)为8，气帘气(CUR)为35psi，雾化电流(NC)为3.0μA，去溶剂气体温度(TEM)为450℃，雾化器(GS1)为55 psi，采集模式为多反应监测(MRM),NDMA、NDEA参数见表2。MS端配备六通阀，0→3.6 min，进入MS;3.6→7.5 min，切换至废液;7.5 min后切换至MS。

　　1.2.2 溶液的制备

　　取约0.3 g供试品，精密称定，置15 m L离心管中，精密加入10 m L 30%甲醇，涡旋1 min使溶解，作为供试品溶液。取NDMA、NDEA对照品适量，精密称定，加甲醇溶解分别制成100、30μg·m L-1的NDMA、NDEA对照品一级贮备液。精密量取NDMA、NDEA一级贮备液适量，加30%甲醇分别稀释成NDMA、NDEA约100、30ng·m L-1的对照品二级贮备液。精密量取对照品二级贮备液适量，加30%甲醇分别稀释成含ND-MA、NDEA约10、3 ng·m L-1的对照品溶液。精密量取对照品溶液适量，加30%甲醇分别稀释成NDMA、NDEA约1 ng·m L-1的系统适用性溶液。

　　表1 流动相的洗脱程序

　　表2 待测物的参数

　　1.2.3 专属性及系统适用性的试验

　　精密量取空白溶剂及对照品、供试品、系统适用性溶液分别进样测定每个样品连续进样6针，记录色谱图(图1)。结果表明:空白溶剂不干扰待测组份测定，NDMA、NDEA的保留时间分别约为3.180、8.624 min，峰形良好，供试品溶液中无其他杂质峰干扰。NDMA、NDEA峰面积的RSD分别为8.69%、4.05%。

　　1.2.4 检测限与定量限的测定

　　精密量取对照品溶液适量，逐级稀释后注入液质联用色谱仪，记录色谱图。信噪比(S/N)约为3时的进样量即为检测限LOD,S/N约为10时的进样量即LOQ,ND-MA、NDEA的检测限分别为0.3937、0.0414 ng·m L-1，定量限分别为0.9514、0.0993 ng·m L-1。

　　1.2.5 线性关系的考察

　　取对照品二级贮备液进行稀释，得一系列不同浓度的线性溶液，分别进样10μL，按“1.2.1”项方法测定，以浓度为横坐标、待测组分峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。线性方程分别为:YNDMA=6.6094×104X-6.9903×103(r=0.9997)、YNDEA=6.9223×104X-1.091×103(r=0.9999)，线性范围分别为0.9514～23.7838、0.0993～7.4582 ng·m L-1。

　　1.2.6进样精密度与重复性的试验

　　取对照品溶液进样，连续进样6针，记录峰面积，计算得NDMA和NDEA峰面积的RSD分别为2.30%、2.36%。说明方法进样精密度良好。取约0.3 g尼扎替丁原料药(批号:171101)，按“1.2.2”项方法平行制备6份供试品溶液，按“1.2.1”项下方法测定，记录峰面积。按外标法计算样品中ND-MA、NDEA的含量，结果表明:供试品中均未检出NDEA,NDMA检出的平均量为0.058 ppm，计算RSD=1.01%，表明方法重复性良好。

　　图1 空白溶剂(A)、对照品(B)和供试品(C)溶液的色谱图(1.NDMA;2.NDEA)

　　1.2.7 加样回收率试验

　　取约0.3 g同一供试品(批号:171101)，共9份，精密称定，置10 m L量瓶中，分别精密加入不同体积的对照品二级贮备液(每个体积平行做3份)，按“1.2.2”项方法制备，得50%、100%、150%限度的加标溶液。取重复性测定结果作为供试品本底值，按“1.2.1”项方法测定，记录峰面积。计算得NDMA的回收率为92.05%～98.93%，平均回收率95.45%,RSD=2.92%,NDEA的回收率为93.74%～100.10%，平均回收率97.33%,RSD=2.35%，结果表明方法准确度较高(表3)。

　　1.2.8 溶液稳定性试验

　　表3 NDMA、NDEA的加样回收率试验(ng,n=9)

　　分别取对照品溶液于0、5、10、12 h时和供试品溶液于0、6、11、14 h时进样，按“1.2.1”项方法测定，记录峰面积，考察溶液的稳定性。结果显示:对照品和供试品溶液各组分峰面积的RSD均小于10%，表明对照品、供试品溶液在12、14 h内稳定。

　　1.2.9 样品的测定

　　取尼扎替丁原料药6批，按“1.2.2”项方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项方法进样分析，按照外标法计算样品中NDMA和NDEA的含量。6批样品MDMA的含量分别为0.06、0.03、0.01、0.01、1.1μg·g-1，有一份样品未检出，样品中均未检出NDEA。

　　1.2.1 0 耐用性的试验

　　取尼扎替丁原料药(批号:171101)及对照品溶液，按耐用性1(调梯度程序为0～4 min、3%B,4～8 min、3%→50%B,8～11 min、50%B,11～12 min、50%→90%B,12～14 min、90%B,14～14.1 min、90%→3%B,14.1～18 min、3%B);耐用性2 (梯度程序为0～4 min、5%B,4～9 min、5%→60%B,9～11 min、60%B,11～12 min、60%→90%B,12～14 min、90%B,14～14.1 min、90%→5%B,14.1～18 min、5%B);耐用性3 (柱温40℃);耐用性4(调柱温50℃);耐用性5(流速0.9 m L·min-1);耐用性6(流速1.1 m L·min-1)中更改后的条件进行测定，记录峰面积，按外标法计算供试品中NDMA、NDEA的含量。因方法筛选时已试验过多根色谱柱，故建议固定色谱柱进行检测，耐用性考察不再更换色谱柱。原方法与6种耐用性条件改变后的方法测得的供试品中NDMA的含量分别为0.0573、0.0493、0.0495、0.0522、0.0481、0.0530、0.0486μg·g-1,RSD=6.42%,NDEA则均未检出，表明方法耐用性良好。

　　2 讨论

　　实验分别采用了Waters BEH C18色谱柱、Kinetex F5 100A色谱柱、Agilent Poroshell C18色谱柱，优化多种色谱条件和前处理方法，最终发现采用Agilent Poroshell C18色谱柱时，NDMA峰形最优，且与尼扎替丁的峰分离良好。此外，进样量较大时，溶剂效应影响明显，溶剂中甲醇的量会极大地影响NDMA的峰形，甲醇量越大，溶剂效应越强，导致NDMA峰形越差。同时考虑ND-MA的溶解性及峰形两个因素，最终选用30%的甲醇作为溶剂。供试品溶液中尼扎替丁的浓度过高，易与NDMA共出峰，影响NDMA的回收，因此，调整优化多个色谱条件，优选出文中条件，在此条件下，尼扎替丁与NDMA、NDEA均能较好分离。为避免高浓度供试品对质谱造成污染，故采用阀切换技术，MS端配备六通阀，0→3.6 min，进入MS,3.6→7.5 min，切换至废液，7.5 min后切换至MS，将主成分尼扎替丁切至废液。尼扎替丁的日最大服用剂量为0.3 g,FDA发布的ND-MA、NDEA的日最大临时限度分别为96、26.5ng，因此，尼扎替丁原料药中NDMA、NDEA分别不得超过0.32、0.088μg·g-1。6批样品的测定结果均远小于规定限度，能满足尼扎替丁原料药中NDMA、NDEA的检测要求，所用方法准确、可靠，专属性强，可用于对尼扎替丁原料药中ND-MA和NDEA的质量控制。

　　参考文献

　　[1]刘书伟．尼扎替丁治疗良性胃溃疡的疗效观察[J]．中国冶金工业医学杂志，2016,33(2):120．

　　[2]张荞琴，李铜铃，程强，等．尼扎替丁含量及有关物质测定方法的改进[J]．华西药学杂志，2004,19(3):217-218．

　　[3]葛雨琦，叶晓霞，乐健，等．N-亚硝胺类基因毒性杂质毒性与检测方法研究进展[J]．药物分析杂志，2020,40(1):83-89．

　　[4]古楠，刘永东，钟儒刚．N-亚硝基二甲胺(NDMA)的环境过程和毒理效应[J]．生态毒理学报，2013,8 (3):338-343．

　　[5]WHITE CM.Understanding and preventing(N-Nitrosodimethylamine) NDMA contamination of medications[J].Ann Pharmacother,2019,54(6):611-614.