人肠道菌群对桃叶珊瑚苷体外转化代谢作用的研究

摘要：

目的研究人肠道菌群对桃叶珊瑚苷体外转化代谢的作用。方法采用体外肠道菌孵育方法，在厌氧条件下，将桃叶珊瑚苷分别与3位健康人肠道菌群共同培养48 h，采用高效液相色谱-串联质谱(HPLCMS/MS)联用技术检测不同时间点孵育体系中桃叶珊瑚苷的相对含量及其代谢产物。结果健康人肠道菌群可转化代谢桃叶珊瑚苷，其主要代谢产物为桃叶珊瑚苷苷元和aucubmines A;其主要代谢途径为脱糖基、氨基化及氧化作用。不同受试者肠道菌群对桃叶珊瑚苷代谢速率存在差异，而桃叶珊瑚苷苷元和aucubmines A在共孵育2 h和4 h后可分别被检测到。结论桃叶珊瑚苷可被健康人肠道菌群代谢，4～8 h主要代谢产物为桃叶珊瑚苷苷元，8 h后代谢产物主要为aucubmines A。

关键词：

桃叶珊瑚苷肠道菌群体外代谢高效液相色谱-串联质谱联用桃叶珊瑚苷苷元 aucubmines A

Effects of human intestinal flora on the metabolic transformation of aucubin in vitro

WU Qinxuan HUANG Xiaoshan WANG Jin GUO Yinping HUANG Weihua SHAO Li

School of Pharmacy,Changsha Medical College; Institute of Clinical Pharmacology,Xiangya Hospital of Central South University;

Abstract：

Objective To study the effects of human intestinal flora on the metabolic transformation of aucubin in vitro.Methods Intestinal bacteria were incubated in vitro. In anaerobic condition,aucubin was incubated with intestinal flora from 3 healthy people for 48 h. High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry( HPLC-MS/MS) was used to determine the relative content and metabolites of aucubin in the incubation system at different point in time. Results The intestinal flora from healthy people metabolized and transformed aucubin,the main metabolites thereof were aucubin aglycone and aucubines A; and the main metabolic pathways thereof were deglycosylation,amination and oxidation. The metabolic rate of aucubin was different among intestinal flora from diffe-rent subjects,and aucubin and aucubines A could be detected after incubation for 2 h and 4 h,respectively.Conclusion Aucubin can be metabolized by intestinal flora from healthy people,the main metabolite is aucubin aglycone for 4 to 8 h,and the main metabolite is aucubmines A after 8 h.

Keyword：

aucubin; intestinal flora; metabolism in vitro; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS); aucubin aglycone; aucubmines A;

桃叶珊瑚苷(aucubin)是一种环烯醚萜苷类化合物。1902年由Bourquelot等首次从日本桃叶珊瑚Aucuba japonica Thunb．种子中发现，1951年Hill和Van Heyningen自桃叶珊瑚叶中分离出纯品[1]。桃叶珊瑚苷分布广泛，在杜仲科、车前草科、玄参科、忍冬科等植物中均有发现，尤其在车前草科植物中含量最高[2-3]。桃叶珊瑚苷具有护肝、解毒、抗肿瘤、抗炎、营养神经、抗氧化等多种药理作用，但其口服后生物利用度不高，仅为19.3%，且肠道吸收率不佳，但其在治疗疾病时仍有较好的效果[4-5]。研究表明，桃叶珊瑚苷在β-葡萄糖苷酶等催化作用下易被水解转化为桃叶珊瑚苷苷元，桃叶珊瑚苷苷元较桃叶珊瑚苷吸收利用度更好，抗肿瘤、抗炎及神经营养作用更佳。

人体肠道内约含1014个肠道菌，可分泌包括β-葡萄糖苷酶在内的多种药物代谢酶以代谢不同结构类型的药物[6-7]。桃叶珊瑚苷多口服给药，会与人肠道菌群相接触。因此，桃叶珊瑚苷易在肠道中发生代谢分解，这也是其肠道吸收利用度差的原因之一。然而目前关于桃叶珊瑚苷与肠道菌群相互作用的研究仍鲜有报道，探究桃叶珊瑚苷与肠道菌群的相互作用对于研究桃叶珊瑚苷在胃肠道的变化及药效机制等具有重要意义。本研究采用体外肠道菌孵育方法，在厌氧条件下将桃叶珊瑚苷与人肠道菌液温孵，采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)联用技术分析其主要代谢产物及其代谢产物的代谢情况，以阐明桃叶珊瑚苷在人肠道菌群作用下的变化，为桃叶珊瑚苷的临床合理使用提供一定的实验依据。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

Shimadzu LC-20A高效液相色谱串联AB API6500质谱仪(美国赛默飞公司)，E500 Gene-Science厌氧培养箱(美国Gene-Science公司)，高压灭菌锅(日本Hirayama公司)，Centrifuge 5810 R高速离心机(美国Eppendorf公司)。

1.2 试剂与材料

桃叶珊瑚苷(上海斐拓化工科技有限公司，HPLC纯度98%，批号102296);厌氧培养基(GAM)粉末(日本株式会社，批号115607);Leibovitz L-15培养基(美国Gibco公司，批号2060481);二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司，批号WXBB8079V);甲醇(批号I0951807816)、乙腈(批号JB085430)均为色谱纯，购自德国默克公司;乙酸乙酯(批号20180910)、正丁醇(批号20190129)均为分析纯，购自中国国药集团有限公司;实验所用水为超纯水(Watsons蒸馏水，批号20190326)。

2 方法

2.1 人肠道菌群的提取与桃叶珊瑚苷的体外代谢

2.1.1 GAM的配制

取GAM粉末7.0 g于100 m L超纯水中超声溶解，115℃高温灭菌15 min，即得GAM溶液，冷却后密封，4℃放置备用。

2.1.2 人肠道菌群的提取

取随机选择的3位健康受试者(无吸烟、饮酒等不良嗜好，生活方式健康，身体健康，3个月内无抗生素或益生元使用记录)的新鲜粪便2.0 g，加入预冷生理盐水40 m L，制成混悬液，以450 r/min离心5 min，取上清液以4000 r/min离心20 min，沉淀加入GAM溶液5 m L重悬，即得肠道菌液。所得菌液加入适量20%甘油冻存(冻存步骤:4℃放置30 min后转入-20℃放置1 h，然后-80℃保存)，使用时复苏即可[8]。

2.1.3 桃叶珊瑚苷的体外代谢

37℃条件下水浴复苏冻存菌液，加入GAM溶液10 m L，得肠道菌菌液。样品孵育体系为:菌液0.2 m L、Leibovitz L-15培养基0.75 m L、桃叶珊瑚苷溶液0.05 m L(DMSO溶解，质量浓度为30 mg/m L);同时设置空白对照。将样品孵育体系置于厌氧培养箱中恒温(37℃)培养。分别于0,2,4,6,8,12,24,36,48 h取样，先以乙酸乙酯0.9 m L萃取，以9500 r/min离心6 min，取上清液0.7 m L;残渣以乙酸乙酯0.7 m L再次萃取，同转速离心，取上清液0.7 m L;最后以水饱和正丁醇0.7 m L萃取，同转速离心，取上清液0.7 m L(2次)。合并4次萃取液，25℃下氮气吹干。加入甲醇150μL复溶，震荡5 min，以13 000 r/min离心10 min，取上清液100μL进样分析，另取桃叶珊瑚苷对照品溶液进样分析。测定不同时间点桃叶珊瑚苷及其代谢物的响应情况，计算桃叶珊瑚苷的剩余率和转化率。剩余率/%=Ai÷A0×100%，转化率/%=(A0-Ai)÷A0×100%(式中Ai为第i个时间点的桃叶珊瑚苷峰面积，A0为0 h的桃叶珊瑚苷峰面积)。每组均设置3个平行对照。

2.2 色谱与质谱条件

2.2.1 色谱条件

Hypersil ODS-C18色谱柱(Thermo,250.0 mm×4.6 mm,5μm)，流动相为水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～2.5 min,97%A;>2.5～17.0 min,97%→95%A;>17.0～20.0 min,95%→90%A;>20.0～30.0 min,90%→75%A;>30.0～45.0 min,75%→55%A;>45.0～55.0 min,55%→35%A;>55.0～75.0 min,35%→10%A)，柱温25℃，进样量5.0μL，流速1 m L/min，三通阀分流后入质谱流速为0.33 m L/min。

2.2.2 质谱条件

采用电喷雾正离子全扫描模式(Q1)，离子喷雾电压5.0 k V，离子源温度450℃，碰撞气N2，气帘气压45 psig，雾化气压47 psig，辅助气压50 psig，去簇电压90 V，质谱扫描范围为80～450 Da。

3 结果

3.1 桃叶珊瑚苷经人肠道菌群代谢转化分析

专属性试验检测结果如图1。孵育体系基质成分不干扰桃叶珊瑚苷的检测，且厌氧培养体系与桃叶珊瑚苷共孵育72 h后桃叶珊瑚苷的含量基本不变，说明培养基对桃叶珊瑚苷的转化无明显影响。桃叶珊瑚苷与人肠道菌群共孵育48 h结果如图2所示，桃叶珊瑚苷M0主要被代谢为M1和M22种物质。桃叶珊瑚苷与肠道菌群孵育8 h期间被快速代谢(图3A),24 h后孵育体系中无法检测出桃叶珊瑚苷。以0 h的桃叶珊瑚苷的峰面积作为100%，如图3A、D所示，桃叶珊瑚苷经菌群转化2 h后峰响应强度降低，相应的剩余率也呈下降趋势，至孵育24 h时，桃叶珊瑚苷含量低于检测限。

3.2 桃叶珊瑚苷在人肠道菌群中的代谢产物分析

根据图2结果，桃叶珊瑚苷经菌群代谢产生M1、M22种代谢物，M1保留时间为7.0 min，一级质谱显示m/z为207.1[M+Na]+、223.1[M+K]+的分子离子峰和175.1[M+Na-CH3OH]+的碎片离子峰，对照文献[9]判断为桃叶珊瑚苷苷元;M2的保留时间为17.2 min，一级质谱m/z为164.1[M+H]+的分子离子峰和327.1[2M+H]+的一级离子峰，推测其为aucubinine A(分子式C9H9NO2)[10]。根据代谢物M1、M2的提取离子色谱结果(图3B、C)，桃叶珊瑚苷和人肠道菌群共孵育2 h后桃叶珊瑚苷苷元即可被检测到，4 h时aucubinine A出现。以2种代谢产物孵育不同时间的提取离子流色谱图峰面积作图(图3E、F)，桃叶珊瑚苷被转化为桃叶珊瑚苷苷元的趋势在不同受试者中一致，但转化速率存在差异，3位健康受试者肠道菌群分别与桃叶珊瑚苷共孵育4,6,8 h时，桃叶珊瑚苷苷元产生量达到峰值;而aucubinine A在共孵育12～24 h响应最强，此后其质谱响应信号逐渐下降。

3.3 桃叶珊瑚苷经人肠道菌群代谢途径分析

通过HPLC-MS结果及推断所得代谢产物可知，桃叶珊瑚苷在人肠道菌群的作用下会发生脱糖基和氨基化反应。如图4所示，桃叶珊瑚苷(C15H22O9,m/z为369.1[M+Na]+)首先被肠道菌群所含酶代谢脱去1分子葡萄糖(-C6H10O5,-162)，变为桃叶珊瑚苷苷元(C9H12O4,m/z为207.1[M+Na]+)，但桃叶珊瑚苷苷元本身不稳定，与其同分异构体相互转化，进一步被氨基化生成氨环，同时羟基被氧化为酮基，生成aucubinine A(C9H9O2N,m/z为164.1[M+H]+)。

4 讨论

早期研究表明，肠道菌群对中药的生物转化至关重要，其可催化酶促反应以代谢肠道中不能被吸收的组分[11-12]。此外，肠道菌群能分泌哺乳动物胃中不具备的水解糖苷键酶，如β-葡萄糖苷酶、鼠李木糖苷酶、木糖苷酶等[13]。因此，本试验采用人粪便提取的肠道菌群与桃叶珊瑚苷进行体外温孵，富集的肠道菌群不仅可在短时间内获得大量且丰富的代谢产物，同时也排除了其他代谢器官的影响，得到桃叶珊瑚苷的代谢均来自于菌群自身代谢。

本试验采用HPLC-MS/MS法分析了桃叶珊瑚苷体外经人肠道菌群代谢的情况，确定了人肠道菌可在12 h内迅速使桃叶珊瑚苷脱去1分子葡萄糖生成桃叶珊瑚苷苷元，并进一步经过氨基化和氧化作用，将桃叶珊瑚苷苷元转化为aucubinine A，但共孵育24 h后aucubinine A含量呈下降趋势，说明其或可被继续代谢，但具体产物仍待进一步研究。此外，3位健康受试者的肠道菌群对桃叶珊瑚苷的代谢速率存在差异，这可能与每位受试者饮食习惯等存在差异有关。然而，具体哪类菌种控制桃叶珊瑚苷的代谢速率需要进一步探究验证。

桃叶珊瑚苷经人肠道菌群代谢后，代谢产物与桃叶珊瑚苷的理化性质有明显差异，可能会直接或间接影响其生物利用度等，进而影响其药理活性。Bartholomaeus A[14]和Lee等[15]的研究发现，桃叶珊瑚苷苷元是桃叶珊瑚苷解毒保肝作用的活性形式，而非桃叶珊瑚苷;此外，Park等[16]研究表明，桃叶珊瑚苷抗炎的作用机制主要是通过其代谢生成桃叶珊瑚苷苷元，从而抑制核转录因子(NF-κB)的活性，进而抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。本研究结果表明，桃叶珊瑚苷到达人肠道后会快速被肠道菌群转化为桃叶珊瑚苷苷元，这可为桃叶珊瑚苷的临床使用提供一定的参考。

参考文献

[1]李杨．杜仲籽中桃叶珊瑚苷的生物转化及药代动力学研究[D]．西安:西北大学，2008.

[2]Taskova R M,Gotfredsen C H,Jensen S R.Chemotaxonomy of veroniceae and its allies in the plantaginaceae[J].Phytochemistry,2006,67(3):286-301.

[3]冯晗，周宏灏，欧阳冬生．杜仲的化学成分及药理作用研究进展[J]．中国临床药理学与治疗学，2015,20(6):713-720.

[4]Suh N J,Shim C K,Lee M H,et al.Pharmacokinetic study of an iridoid glucoside:aucubin[J]. Pharm Res,1991,8(8):1059-1063.

[5]韩曼飞，张刘强，李医明．天然桃叶珊瑚苷及其衍生物的化学结构和药理作用研究进展[J]．中草药，2017,48(19):4105-4113.

[6]Koppel N,Maini Rekdal V,Balskus E P.Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota[J].Science,2017,356(6344):1246-1257.

[7]翁仔淼，吕珊珊，葛广波，等．肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的研究进展[J]．药学进展，2018,42(3):177-186.

[8]CHEN M Y,SHAO L,ZHANG W,et al.Metabolic analysis of Panax notoginseng saponins with gut microbiota-mediated biotransformation by HPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS[J]. J Pharm Biomed Anal,2018,150:199-207.

[9]LYU P Y,FENG H,HUANG W H,et al.Aucubin and its hydrolytic derivative attenuate activation of hepatic stellate cells via modulation of TGF-beta stimulation[J]. Environ Toxicol Pharmacol,2017,50:234-239.

[10]杨小宝，花成文，翟宏斌．单萜吡啶生物碱Aucubinine A的合成[J]．有机化学，2004,24(11):1429-1431.

[11]Lee D S,Kim Y S,Ko C N,et al.Fecal metabolic activities of herbal components to bioactive compounds[J]. Arch Pharm Res,2002,25(2):165-169.

[12]XUE B,XIE J,HUANG J,et al.Plant polyphenols alter a pathway of energy metabolism by inhibiting fecal Bacteroidetes and Firmicutes in vitro[J]. Food Funct,2016,7(3):1501-1507.

[13]KONG L T,WANG Q,XIAO B X,et al.Different pharmacokinetics of the two structurally similar dammarane sapogenins,protopanaxatriol and protopanaxadiol,in rats[J].Fitoterapia,2013,86:48-53.

[14]Bartholomaeus A,Ahokas J.Inhibition of p450 by aucubin:is the biological activity of aucubin due to its glutaraldehyde-like aglycone?[J]. Toxicol Lett,1995,80(1-3):75-83.

[15]Lee D H,Cho I G,Park M S,et al.Studies on the possible mechanisms of protective activity against alpha-amanitin poisoning by aucubin[J]. Arch Pharm Res,2001,24(1):55-63.

[16]Park K S,Chang I M.Anti-inflammatory activity of aucubin by inhibition of tumor necrosis factor-alpha production in RAW 264.7 cells[J]. Planta Med,2004,70(8):778-779.